怎么筛选出来这个蛋白的？
筛选出来之后如何验证蛋白功能的特异性？
何种功能参与了调控病毒复制？
筛选到的基因在人与蝙蝠中表达水平有何不同？
如何利用这个靶标研发新药？
简单来说，学者们用了两个方法，一个是全基因组敲除，一个是全基因组沉默。
实验的对象是蝙蝠来源的肾脏上皮细胞Paki。
1.1 蝙蝠细胞溯源
这个细胞可以追溯到2009年，同样也是本文的通讯作者之一的王林发教授发表于Plos One上的一篇文章[1]。
作者当时从蝙蝠的各种组织里进行原代培养，原代细胞一般只能培养10代左右就会死亡，不能长期培养，所以实验室经常使用的细胞都是永生化的，比如癌细胞等等，所以作者开始对分离的蝙蝠原代细胞进行永生化。
用的策略有两种：一种是常用的猿猴病毒40（SV40）的大T抗原，SV40是一种多瘤病毒，大T抗原可以诱导细胞的癌变，也就是永生化。另外一种策略是端粒酶，我们知道染色体是线性的DNA，DNA复制的时候其长度是在不断缩短的，缩短的部分就是端粒，端粒缩短到最后染色体就不能再复制，细胞死亡。而端粒酶（TERT）在某些细胞，比如癌细胞中表达丰富，可以延长端粒，使得这些细胞的寿命不受限制。所以转入端粒酶也可以使得原代细胞永生化。
作者虽然原代培养了很多蝙蝠组织，但是通过两种方法最终实现单克隆建系的只有四个组织来源的成功了：脑（brain）、肺（lung）、肾（kidney）和胎兽（Foetus）。而这篇即将发表在CNS（大概率Nature）的文章使用的就是来源于蝙蝠肾脏组织的建系细胞——PaKi。
1.2 高通量筛选圈目标
不管什么生物，基因数量都是庞大的，怎么在茫茫基因库中找寻到可以影响病毒复制的关键基因呢？作者在蝙蝠细胞上使用了两种当下很常用的筛选方式——CRISPR基因敲除筛选和RNA干扰筛选（RNAi）。
CRISPR基因敲除的由来就不介绍了。简单说一下这里筛选的步骤与原理：先用表达几万个基因靶点的慢病毒文库转导PaKi细胞，这时候拿到的细胞群体就是一个文库病毒感染的细胞库。是一个混合的群体，这个细胞群体里被敲除的基因会有一个频率，我们把这个频率视为基因敲除的本底。而对这个群体进行甲型流感病毒的感染，感染病毒的细胞会死亡，留下来的就是存活的细胞，这部分细胞被敲除的基因频率肯定和原始的本底基因敲除频率不一样，所以两个敲除基因频率相比较就可以得到哪些病毒参与了病毒的复制。
第二种RNAi的方式是一种更为“古老”的方式，步骤和策略主要是用几万种基因的靶向小RNA转染到细胞，这些小RNA（siRNA）可以把已经离开细胞核的信使RNA（mRNA）降解，使得相应mRNA翻译的蛋白水平降低（一般蛋白的半衰期都不长，没有mRNA来翻译补充就会越来越少），这种策略叫做基因沉默，因为不影响基因组DNA，只是蛋白表达降低了。这时候再用表达绿色荧光蛋白（GFP）的腮腺炎病毒去感染。正常情况下细胞肯定被感染，所以能检测到绿色，但是某些siRNA处理的细胞上病毒感染产生荧光强度会降低或直接不产生荧光，这时候就可以知道哪些基因影响了腮腺炎病毒的感染了，也是一种高通量筛选的策略。
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利用这两个筛选策略，作者筛选到了很多影响病毒复制的基因，主要筛选到的基因集中在蛋白分泌（与病毒出胞相关）、内吞（与病毒入胞相关）和蛋白翻译起始相关的蛋白。
而两组都筛选到的这些常规通路之外的基因就有亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD1)。
1.3 筛选到的MTHFD1是不少RNA病毒复制的必需基因
结果发现，不管是用CRISPR敲除基因还是用RNAi沉默基因的表达的方式，干掉MTHFD1之后，流感病毒、腮腺炎病毒和寨卡病毒的复制水平都是降低的。
脱靶效应是生物实验中必须要考虑的一个问题，也就是筛选到的MTHFD1基因沉默后确实而不是其他的效应造成病毒复制降低的。这时候常用的策略是“回补”。也就是额外在MTHFD1基因沉默的细胞中继续表达另外的不受小干扰RNA影响的基因，结果发现不管是人的还是蝙蝠的MTHFD1都可以恢复之前因为沉默MTHFD1而降低的病毒复制水平。
既然已经筛选到了MTHFD1，那么这个蛋白本身的什么功能起到了辅助病毒复制的作用呢？
MTHFD1作为一个酶，具有几个不同的催化活性，包括脱氢酶、环化水解酶和四氢叶酸合成酶三种活性。
参与的生化反应主要集中在核苷酸的一碳代谢上。从生化反应路径上可以看到从四氢叶酸与甲酸盐反应生成10-甲酰四氢叶酸开始一直到生成5,10-亚甲基四氢叶酸上都有MTHFD1参与。
而MTHFD1发挥这些功能的酶活中心在于几个关键的氨基酸，将这些氨基酸突变之后就会使得MTHFD1失去这些功能，所以如果上面的实验中回补的是这些MTHFD1突变体，将可以指导到底是MTHFD1的哪种功能结构域参与辅助了病毒的复制。
而根据回补的不同MTHFD1突变体对病毒复制影响的结果来看——FW/AA，也就是合成酶结构域突变的的MTHFD1不能回复病毒的复制。所以，对于病毒复制来说，MTHFD1的关键功能在于合成酶这一步。
那么是不是可以据此进一步知晓，在病毒感染MTHFD1缺失的细胞中，加上不同的核苷酸代谢产物是不是也能起到回补MTHFD1的效应？
使用了四种不同的核苷（酸）（次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷/肌苷、胸腺嘧啶核苷/胸苷、5-甲基四氢叶酸），结果发现添加次黄嘌呤和肌苷能够起到恢复病毒复制的效果，而胸苷和5-甲基四氢叶酸则不行，进一步说明MTHFD1辅助病毒复制的作用在于合成酶结构域。
既然MTHFD1是利用蝙蝠筛选出来的基因，那么这个基因在蝙蝠和人里面表达水平有何不一样呢？
结果发现MTHFD1这个基因在黑妖狐蝠（或中央狐蝠）、大长舌果蝠两种果蝠里的表达水平要低于人类，用的人的细胞包括胚胎肾脏细胞（293T）、肺腺癌细胞（A549）和肝癌细胞（Huh7）。而在肝脏和脾脏的组织中两种果蝠的MTHFD1表达水平也低于人类。
这可能暗示了为什么病毒在蝙蝠里致病性会弱，可能部分因为MTHFD1在蝙蝠里表达水平偏低，进而导致病毒在蝙蝠里的复制水平可能要低于人类。
既然已经知道了MTHFD1的合成酶功能可以显著促进病毒的复制，那么有没有抑制这个酶活性的抑制剂呢？是不是可以作为抑制病毒复制的广谱抗病毒药物？
实际上还真有，这就是一种来源于大自然的的产物——carolacton[2]。这种分子是一种来自于纤维囊黏液杆菌（myxobacterium Sorangium cellulosum）的代谢产物[3]。
作为黏菌来源的代谢产物，首先想到的肯定是用于细菌感染的治疗，实际上carolacton是一种对致病突变肺炎链球菌（mutant S. pneumoniae）形成生物膜的有效抑制剂。
那么carolacton是怎么联系到MTHFD1上的呢？
2017年一项研究表明carolacton在细菌的靶标是FolD，也就是叶酸依赖的一碳单位代谢中的关键酶[4]。 而carolacton抑制FolD的浓度在纳摩尔（nM）级别。与此同时，这篇文章的作者还发现FolD在人体中的同源分子，也就是MTHFD1和MTHFD2的活性也可以被carolacton所抑制，有效浓度也是纳摩尔级别。
那么carolacton是不是可以抑制上面发现的依赖MTHFD1复制的病毒呢？
肯定，对寨卡病毒和腮腺炎病毒的半数有效抑制浓度都在纳摩尔级别（0.24μM和0.12μM），而且半数细胞毒性都在10μM以上（换算出的选择指数SI＞41.7、83）。
目前新冠病毒正在流行，作为蝙蝠来源的病毒，carolacton是不是对新冠病毒也有抑制作用？答案也是肯定的，半数有效抑制浓度为0.14μM。相比较之下，比之前石正丽研究员筛选瑞德西韦得到半数有效抑制浓度为0.77μM要低（https://zhuanlan.zhihu.com/p/114381784。）。
和之前日本东京大学开新闻发布会通报的萘莫司他一样，carolacton针对的靶点是宿主分子，不像瑞德西韦针对的靶标是病毒蛋白。所以有可能可以作为一种广谱的抗病毒分子，并且不太可能产生耐药性（但是carolacton在体内使用的是否具有毒性需要进一步的评价）。
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小结：
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