一次柠檬酸循环经历两次脱羧、四次脱氢反应，生成 3 分子 NADH 和 1 分子 FADH2，一次底物水平磷酸化，生成 1 分子 GTP（相当于 ATP）。所有还原性辅酶进入电子传递链后，共产生 10 分子 ATP，若从丙酮酸脱羧开始算起，则一共产生 12.5 个 ATP。
柠檬酸循环一共有八步反应，可以在第一次循环将草酰乙酸上的两个碳原子以 CO2的形式释放，而将来自乙酰 CoA 的两个碳原子保留在再生的草酰乙酸中。
具体反应过程如下：
①乙酰 CoA 进入三羧酸循环
乙酰 CoA 与草酰乙酸（Oxaloacetate）合成柠檬酸，该反应由柠檬酸合酶 （Citrate synthase）催化，具有严格立体专一性。该反应不可逆，是柠檬酸循环的限速步骤。该酶也受到多种效应物的调控，比如受到 ATP、NADH、琥珀酰 CoA、酯酰 CoA，以及结构类似物氟乙酰 CoA 和丙酮基 CoA 的抑制。
②异柠檬酸形成
柠檬酸的叔醇基不易氧化，转变成异柠檬酸而使叔醇变成仲醇，就易于氧化， 此反应由（顺）乌头酸酶（Aconitase）催化。
③第一次脱氢——异柠檬酸氧化形成α-酮戊二酸
在异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase）作用下，异柠檬酸的仲醇氧化成羰基，生成草酰琥珀酸的中间产物，后者在同一酶表面，快速脱羧生成α-酮戊二酸、1 分子 NADH 和 CO2。该酶可以 NAD+和 NADP +作为辅酶，前者只在线粒体中存在并且需要 Mg 2+和 Mn 2+激活，后者在细胞溶胶中也存在。异柠檬酸酶还是一个变构调节酶，其活性受到 NAD+、ADP 的激活，NADH 和 ATP 对其有抑制作用。
④第二次脱氢——α-酮戊二酸氧化脱羧形成琥珀酰-CoA
在α-酮戊二酸脱氢酶系（α-ketoglutarate dehydrogenase）作用下，α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰-CoA、1 分子 NADH、一分子 H+和 CO₂，氧化产生的能量中一部分储存于琥珀酰-CoA 的高能硫酯键中。该酶系组成与丙酮酸脱氢酶系组成相同，作用方式类似，也需要 TPP、硫辛酸、CoA、FAD、NAD+和 Mg 2+辅助，它们的活性调控方式也类似，受到琥珀酰-CoA、NADH 以及高细胞能荷的抑制。
⑤琥珀酰-CoA 转化成琥珀酸并产生一个高能磷酸键
在琥珀酸-CoA 合成酶（Succinyl-CoA synthetase）的作用下，琥珀酰-CoA的硫酯键水解，释放的自由能用于合成 GTP（底物水平磷酸化），在细菌和高等生物可直接生成 ATP，在哺乳动物中，先生成 GTP，再生成 ATP，此时，琥珀酰 CoA 生成琥珀酸和辅酶 A。
⑥第三次脱氢——琥珀酸脱氢形成延胡索酸
琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase）催化琥珀酸氧化成为延胡索酸，
同时脱除的 2 分子 H 被 FAD 接受，生成一分子 FADH2，具有严格的立体专一性。由于 FAD 与酶共价结合因此 FAD 是该酶的辅基。丙二酸结构与琥珀酸相似， 是琥珀酸脱氢酶的强烈抑制剂。与 TCA 途径其他酶不同，琥珀酸脱氢酶存在于 线粒体内膜上。
⑦延胡索酸的水合形成 L-苹果酸
延胡索酸在延胡索酸酶（Fumarase）作用下与水分子反应，生成苹果酸。 该酶具有严格的立体专一性，只形成 L-苹果酸。
⑧第四次脱氢——L-苹果酸脱氢形成草酰乙酸
在苹果酸脱氢酶（Malate dehydrogenase）作用下，苹果酸仲醇基脱氢氧化成羰基，生成草酰乙酸，同时脱除的 H 被 NAD+接受，生成 1 分子 NADH，具有立体结构专一性。
